Introdução

Várias doenças que envolvem as membranas mucosas da boca são descobertas durante um exame clínico de rotina. Ocasionalmente, estas alterações teciduais apresentam características clínicas únicas que sugerem um diagnóstico específico. Entretanto, uma proporção significativa de casos cria dilemas no diagnóstico. O recurso semiotécnico mais amplamente aceito para o diagnóstico das lesões da boca é a biopsia. No entanto, em situações clínicas específicas, o diagnóstico pode ser estabelecido por meio da citologia esfoliativa (Jones et al., 1995).
Do ponto de vista conceitual, Pereira-Pinto et al. (1997) definem a citologia esfoliativa como um exame complementar que tem sua fundamentação no estudo microscópico de células esfoliadas da superfície epitelial. Os estudos de Papanicolaou, iniciados em 1923, possibilitaram a padronização de uma metodologia que, utilizando esfregaços citológicos vaginais, permitia o diagnóstico do câncer pelo reconhecimento ao nível de células isoladas, com as mesmas características de malignidade observadas nas células dos cortes de tecido. A ampla aceitação do método colpocitológico, graças aos seus resultados positivos, fez com que a mesma metodologia fosse aplicada a quase todas as regiões anatômicas do corpo humano, incluindo a boca (Marcucci & Araújo 1980).
      Um grande número de estudos foi realizado para avaliar ao emprego da citologia esfoliativa como um recurso de diagnóstico na identificação de lesões cancerizáveis e do câncer bucal durante a década de 60 (Sciubba, 1999). O resultado destes experimentos não foram encorajadores o que acarretou na taxação da citologia esfoliativa bucal como um recurso diagnóstico capaz de produzir resultados irreais, conforme evidenciado pela elevada percentagem de resultados falso-negativos em casos de câncer bucal (Rovin, 1967; Shklar et al. 1970; Folsom et al. 1972; Ogden et al., 1997).
      Recentemente, foi desenvolvida a citologia esfoliativa em meio líquido que tem sido apontada como uma metodologia que poderá substituir o convencional tipo de exame de citologia esfoliativa preconizado por Papanicolaou. Este novo recurso foi bem aceito no meio ginecológico, tendo em vista que ele resolveu alguns problemas de adequação dos espécimes, pois ele tirou a responsabilidade da preparação das lâminas e fixação do cirurgião-dentista. Além disso, esta tecnologia fornece preparações uniformemente bem fixadas e que são livres de células sangüíneas (Herbert & Johnson, 2001).
      Campagnoli (2003) utilizou a citologia esfoliativa em base líquida no diagnóstico do câncer bucal. Seus achados revelaram que esta técnica fornece amostras mais homogêneas e lâminas de melhor qualidade, o que proporcionou uma redução no número de amostras insatisfatórias e um aumento de sensibilidade do exame. No mesmo ano, Sandrin (2003) comparou o uso da citologia esfoliativa convencional com a citologia esfoliativa em meio líquido no diagnóstico da candidose bucal. Os resultados mostraram que esta nova modalidade foi mais eficaz que a técnica convencional devido ao maior número de lâminas contendo hifas e/ou pseudohifas, bem como pela quantidade e dispersão mais uniformes das células epiteliais, o que caracterizou a qualidade superior das imagens neste método.
      A citologia em base líquida surgiu também para viabilizar a leitura das lâminas por meio dos computadores, uma vez que era necessária uma técnica que permitisse a confecção de lâminas apresentando um menor número de artefatos e sobreposições de células (Digene do Brasil, 2002).
A sobreposição de células presentes nas lâminas da citologia esfoliativa pode ser o resultado da aglutinação proporcionada pela presença de saliva sobre a lesão no momento da coleta de material. A saliva é um fluido de composição variável, difícil de ser definido tanto física quanto quimicamente, que é produzido pelas glândulas salivares e que atinge o volume total de 0,5 – 1,0 litro/dia. Os componentes da saliva contribuem para o recobrimento da mucosa, proteção antimicrobiana e digestão. Esta secreção desempenha um papel relevante na manutenção da saúde bucal e alterações que afetam as funções salivares que podem comprometer a integridade dos tecidos moles e duros da boca e gastrintestinais (Pedersen et al., 2002; Gindzienski et al., 2003).
      Além da grande quantidade de componentes inorgânicos, a saliva contem um grande número de proteínas que participam da proteção de tecidos bucais, tais como a lisozima, lactoferrina, lactoperoxidase, imunoglobulinas, aglutininas e mucinas (Thomsson et al., 2002). As glicoproteínas, em especial, contêm quantidades variadas de carboidratos ligados ao seu núcleo protéico. A variabilidade das cadeias laterais contribui para o polimorfismo das glicoproteínas, todas elas exibindo propriedades diferentes, como por exemplo, a formação da película e adesão celular (Thylstrup, 2001).
      As mucinas são glicoproteínas de alto peso molecular secretadas pelas células de revestimento dos tratos gastrintestinal, respiratório e reprodutor (Liu et al., 2002). As mucinas salivares, secretadas pelas glândulas submandibulares, sublinguais e acessórias, são constituintes da saliva total e protegem a superfície das mucosas do ressecamento, das injúrias mecânicas e da invasão de microorganismos (Baughan et al. 2000; Liu et al., 2002).
      Quando secreções salivares, como a saliva parotídea ou da submandibular e, particularmente, a saliva total, são adicionadas a uma suspensão de micróbios, seguidas vezes ocorre uma agregação específica espontânea. As proteínas salivares ligam-se aos microorganismos por meio de diferentes tipos de reações. As mucinas podem realmente possuir reações polivalentes ou múltiplas com diversas bactérias, provocando um baixo nível de aglutinação. Algumas proteínas salivares de alto peso molecular, tais como as aglutinias, possuem atividade de grupo sangüíneo e podem aglutinar uma variedade de diferentes tipos de microorganismos por meio de interações carga-carga ou de receptores específicos de carboidratos (Nieuw et al., 2002). Já é sabido que a enolase de superfície é um dos ligantes responsáveis pela adesão do Streptococcus mutans a mucina GM2 salivar (Ge et al., 2004). Uma vez que as células epiteliais da mucosa bucal também possuem grupo sangüíneo e seqüências de carboidratos semelhantes em sua superfície, as glicoproteínas salivares podem propiciar uma inibição competitiva limitada para esses locais de ligações nas bactérias. Deve ser enfatizado que as células epiteliais descamadas e degeneradas estão literalmente cobertas in vivo por microorganismos (Boackle & Suddick, 1984). Estas substâncias são responsáveis pela agregação de uma grande variedade de espécies bacterianas e de células (Liu et al., 2000; Thomsson et al., 2002; Ahn et al., 2003).
      As mucinas constituem uma família com pelo menos dois membros, designados GM1 e GM2 (Bolscher et al., 1999) que são originadas dos genes MUC5B e MUC7, respectivamente (Thornton et al., 1999). As GM1 têm alto peso molecular e são sintetizadas exclusivamente pelos ácinos mucosos (Amerongen et al., 1995; Liu et al., 2002; Veerman et al., 2003; Piludu et al., 2003). As GM2 têm baixo peso molecular e podem ser encontradas em todas as glândulas salivares sero-mucosas (Bolscher et al., 1999; Veerman et al., 2003; Piludu et al., 2003).
      De acordo com Jones et al. (1995), a coleta de um número adequado de células epiteliais e a distribuição uniforme destas sobre a superfície das lâminas são dois requisitos imprescindíveis para garantir um diagnóstico citopatológico preciso.  Tomando por base esta regra, o presente trabalho teve como objetivo avaliar se a qualidade das lâminas obtidas pela técnica da citologia em base líquida no diagnóstico de lesões bucais sofre interferências quanto a presença ou não de saliva no momento da coleta das células pela técnica da citologia esfoliativa em meio líquido.

Materiais e Métodos

      Foi realizado um estudo experimental do tipo ensaio clínico randomizado do paradigma quantitativo. Este trabalho foi iniciado após seu protocolo ser submetido à apreciação e aprovação pelo Colegiado do Curso de Odontologia e pelo Comitê de Ética em Pesquisa na área de saúde da PUCPR.
      A amostra usada neste experimento foi composta de 36 indivíduos adultos, de ambos os sexos atendidos na clínica Odontológica da PUCPR. Todos os pacientes que participaram desta pesquisa foram orientados a realizar um enxágüe bucal com água para remover restos necróticos e alimentares. A coleta das amostras foi realizada em duas etapas. Na primeira, as células eram obtidas em campo úmido, ou seja, com a presença de saliva (grupo experimental). Enquanto que na segunda, a coleta das células era executada em campo seco, após secagem com ar comprimido por 20 segundos usando a seringa tríplice do equipo odontológico (grupo controle).
      A coleta das células epiteliais foi realizada com um kit do sistema DNA-CitoliqÒ (Digene do Brasil, 2002), denominado Universal Collection Medium (UCM) que é composto por uma escova de cerdas de nylon e cabo longo e um tubo plástico contendo um líquido preservador da amostra. Esta manobra foi obtida por meio da aplicação da escova de forma suave e em movimentos giratórios no sentido horário (cinco voltas). Em seguida, a escova foi mergulhada no interior do frasco contendo o UCM, que permaneceu imersa neste líquido com o frasco tampado até o momento da preparação das lâminas. A impressão das células sobre a lâmina histológica foi realizada por meio de prensagem (Prepgene do sistema DNA-CitoliqÒ) usando um filtro especial contendo uma membrana de policarbonato (Lamigene do sistema DNA-CitoliqÒ) segundo as instruções do fabricante. A seguir, as lâminas foram fixadas por 20 minutos em solução de álcool etílico absoluto e coradas pela técnica de coloração do Papanicolaou. A análise citopatológica das lâminas foi feita com as mesmas mascaradas com auxílio de um microscópio de luz (Olympus BX50), objetiva de PLAN4X/0,10, ocular WH10X-H/22 e um sistema analisador de imagens (IMAGE PRO-PLUS versão 4.5 for Windows, Media Cybernetics, Silver Spring, MD USA). A análise das lâminas foi realizada levando em consideração as seguintes variáveis:
-Tipo Celular (Sugerman & Savage, 1996):
•Número de células superficiais anucleadas e nucleadas;
•Número de células intermediárias;
•Número de células da camada basal;
•Número de células atípicas.
-Dispersão Celular (Sugerman & Savage, 1996):
•Células dispersas;
•Células levemente agrupadas;
•Células agrupadas.
      Os dados obtidos foram tabulados e submetidos aos seguintes testes estatísticos: teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnoff, teste T de Student, teste não paramétrico de Wilcoxon, teste da significância das mudanças de MacNemar e teste estatístico de uma proporção populacional.

Resultados

      O resultado da contagem de células presentes em cada lâmina revelou que o número de células epiteliais das diversas camadas analisadas teve valores maiores nas lâminas colhidas em meio úmido do que em campo seco.
A distribuição do número médio de células e os respectivos desvio-padrões encontram-se disponíveis na Tabela 1. O teste T de student demonstrou que há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de células epiteliais dos vários extratos a um nível de significância de p£0,05. Uma vez que as variáveis não apresentaram uma distribuição normal, utilizou-se o teste não paramétrico de Wilcoxon que confirmou os resultados do teste T de student.
      A análise da presença de áreas de sobreposição celular demonstrou que as lâminas obtidas em campo úmido apresentaram um maior número de áreas de sobreposição de células quando comparadas as lâminas de escovados colhidos em campo seco (Tabela 2). O teste da significância das mudanças de MacNemar revelou que existe uma diferença estatística significativa a um nível de p£0,01 para esta variável. Além disso, baseado no teste estatístico de uma proporção populacional pode-se afirmar que (com 95% de confiança para essa amostra de 36 coletas) para as coletas em campo seco existe uma proporção estatística e favorável  (p=0,01)   para  observar  nas  lâminas  as células dispersas entre si. Já para as coletas em campo úmido, não se pode afirmar que existe uma maior probabilidade de observar células agrupadas (p=0,21876).

Tabela 1 - Média e desvio-padrão do número de células epiteliais obtidas pela citologia esfoliativa em meio líquido segundo a presença ou não de saliva - Curitiba/PR (2005)

Discussão

      A citologia em base líquida representa um aperfeiçoamento do método desenvolvido por Papanicolaou, onde as amostras celulares são guardadas em frascos contendo solução preservadora em quantidade suficiente para a realização de um variado número de lâminas adicionais, tanto para estudo citomorfológico quanto para citoquímico e imunocitoquímico, sendo uma das principais vantagens desta nova metodologia. Isto é possível porque o líquido preservador mantém as propriedades da amostra, possibilitando a análise por métodos de biologia molecular e imunocitoquímica, além de otimizar os recursos para a avaliação de agentes etiológicos infecciosos comuns, relacionados ou não a carcinogênese (Sugerman & Savage, 1996; Ogden et al., 1997; Digene do Brasil, 2002).
Por se tratar de uma metodologia recém desenvolvida para ser usada como recurso de diagnóstico pela ginecologia, ainda não se dispõe de muitos dados a respeito de seu emprego efetivo na clínica odontológica.  Alguns estudos têm demonstrado que a citologia em base líquida diminui o número de escovados insatisfatórios, aumentando o número de alterações celulares identificadas. Esta técnica também melhorou a qualidade  da  amostra,  o   que proporcionou  uma redução dos resultados falso-negativos (Campagnoli, 2003; Sandrin, 2003).
      Esta pesquisa teve por objetivo avaliar se a presença de saliva no momento da coleta de células pela técnica da citologia esfoliativa em meio líquido poderia influenciar de forma positiva ou negativa na qualidade das lâminas e conseqüentemente na avaliação pelo patologista. Pois, de acordo com a literatura, um número adequado de ceratinócitos e lâminas apresentando uma distribuição equilibrada de células epiteliais são requisitos fundamentais que deveram ser cumpridos para se obter êxito no diagnóstico citopatológico (Jones et al., 1995). Sendo assim, foi feita a contagem dos tipos de células presentes nas lâminas em função das várias camadas do tecido epitelial e também do número de áreas de sobreposição celular em cada lâmina. Os resultados obtidos revelaram que o número de células epiteliais das diversas camadas analisadas teve valores médios maiores nas lâminas colhidas em meio úmido do que em campo seco. A aplicação do teste T de student demonstrou que há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de células epiteliais das várias camadas a um nível de significância de p<0,05. Diante deste achado, fica evidente que a presença de saliva sobre a lesão a ser investigada pela citologia esfoliativa seria importante quando se pretende ter um número satisfatório de células para ser avaliado.
      Com relação à dispersão celular, os resultados revelaram que 72,2% das amostras coletadas sem saliva apresentaram as células arranjadas de forma bem dispersa enquanto que nas amostras de campo úmido o percentual foi de 25%. As áreas de sobreposição de células foram mais observadas nas amostras obtidas com saliva e representaram cerca de 73%. Já nas amostras colhidas em campo seco, às áreas de sobreposição equivaleram a 27%. Com relação a estes achados observados quanto a dispersão celular e suportados pelo teste estatístico de uma proporção populacional, pode-se afirmar que nas coletas realizadas em campo seco, existe uma maior propensão de se obter células epiteliais dispersas em relação ao número de células levemente agrupadas ou mesmo agrupadas. Já para as amostras coletadas em campo úmido, não se pode afirmar que existe uma maior propensão de se encontrar ceratinócitos agrupados em relação às células levemente agrupadas ou mesmo dispersas.
      Ao se coletar células epiteliais sem a secagem prévia do campo para se eliminar a cobertura da saliva, aumenta a probabilidade de se ter uma grande quantidade de áreas de sobreposição celular que pode contribuir de forma negativa para a leitura das lâminas pelo patologista e, desta forma, mantendo a citologia esfoliativa como um recurso semiotécnico produtor de imagens irreais e de um grande número de resultados falso-negativos conforme aponta a literatura (Rovin, 1967; Shklar et al. 1970; Folsom et al. 1972).
A saliva representa um mecanismo de defesa importante para os tecidos duros e moles da boca e possui uma grande quantidade de substâncias químicas diferentes diluídas em água (Thomsson et al., 2002; Gindzienski et al., 2003). Alguns destes componentes salivares poderiam justificar esta grande quantidade de sobreposição de células que são indesejáveis no momento da leitura da lâmina.  Provavelmente, esta ação estaria ligada as glicoproteínas salivares relacionadas com as propriedades de lubrificação e aglutinação do meio bucal.  A principal proteína do grupo das glicoproteínas com essa propriedade de agregação é a mucina e mais especificamente a mucina do tipo GM1 (Amerongen et al., 2004). De acordo com Thylstrup (2001), as mucinas do tipo GM2 também são capazes de aglutinar bactérias e células epiteliais.
      As aglutininas salivares também são proteínas altamente glicosiladas com uma massa molecular de aproximadamente 340kDa que carregam antígenos ativos do grupo sangüíneo e possuem a capacidade de interagir com grande número de bactérias íntegras, resultando em aglutinação dos microorganismos em grandes agregados que são eliminados mais facilmente pela saliva por meio da deglutição (Nieuw et al., 2002). Este mesmo fato também é observado com as células epiteliais que descamam da mucosa bucal, pois estas se encontram superficialmente cobertas por microorganismos (Boackle & Suddick, 1984). No entanto, estudos mais específicos direcionados a investigar o real conteúdo das áreas de sobreposição são necessários para confirmar esta hipótese. Caso realmente as áreas de sobreposição de células estejam realmente relacionadas com a presença das glicoproteínas salivares responsáveis pela aglutinação, a técnica da citologia esfoliativa em base líquida deveria encontrar recursos para evitar tal reação dentro do frasco coletor. De acordo com Boackle & Suddick (1984), o fenômeno de agregação pode ser inibido pelas próprias enzimas do soro, tais como as enzimas do sistema complemento.
Desta maneira, é importante reforçar que, antes de coletar material da lesão a ser investigada pela técnica da citologia esfoliativa em meio líquido, o cirurgião-dentista deverá executar a secagem do campo ou mesmo fazer um isolamento relativo com rolos de algodão. Estas manobras podem evitar a presença da saliva sobre a superfície da lesão que pode ajudar a produzir artefatos na lâmina e prejudicar o diagnóstico do caso.

Conclusões
      Baseado nos resultados encontrados neste estudo pode-se concluir que:
-A saliva que recobre as lesões da mucosa bucal é capaz de interferir na quantidade do número de células colhidas e na qualidade das lâminas obtidas pela técnica da citologia esfoliativa em meio líquido em função da presença de áreas de sobreposição de células que podem interferir de forma negativa no diagnóstico final do caso.
-É recomendável a secagem do campo com ar comprimido por um tempo mínimo de 20 segundos antes da coleta de células para análise citopatológica.

Referências Bibliográficas
Ahn S. et al. Adhesion of oral streptococci to experimental bracket pellicles from glandular saliva. Am J Orthod Dentofacial Orhop; 124:198-205, 2003.
Amerongen, AVN. et al. Salivary Proteins: Protective and Diagnostic Value in Cariology? Caries Research; 38: 247-253, 2004.
Baughan LW. et al. Salivary mucin as related to oral Streptococcus mutans in elderly people. Oral Microbiol Immunol; 15(1):10-4, 2000.
Boackle, RJ & Suddick, RP. Proteínas salivares e saúde bucal. In: Menaker L. Cáries dentárias bases biológicas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1986, p. 102-16.
Bolscher, JGM. et al. Detection and quantification of MUC7 in submandibular, sublingual, palatine, and labial saliva by antipeptide antiserum. J Dent Res; 78:1362–1369, 1999.
Campagnoli, EB. Comparação entre a citologia em base líquida e a citologia convencional no diagnóstico de carcinomas bucais. 2003 (Dissertação de mestrado em Odontologia). PUCPR/Curitiba 83p.
Digene do Brasil. Sistema DNA-Citoliq, a citologia em nova era. Manual técnico de treinamento. São Paulo: Digene, 2002. 37p.
Folsom, TC. et al.  Oral exfoliative study: review of the literature and report of a three-year study. Oral Surg Oral Med Oral Pathol; 33:61-74, 1972.
Ge J. et al. Streptococcus mutans surface -enolase binds salivary mucin MG2 and human plasminogen. Infection and Immunity; 72(11):6748-52, 2004.
Gindzienski, A. et al. The role of mucus and its components in protection and repair within the alimentary tract mucosa: polish experience. J Physiol Pharmacol; 54(S3):127-44, 2003.
Herbert, A & Johnson, J. Personal view. Is it reality or an illusion that liquid-based cytology is better than conventional cervical smears? Cytopathology; 12:383-9, 2001.
Jones, AC. et al. Oral cytology: indications, contraindications, and technique. General Dentistry; 43:74-7, 1995.
Liu B. et al. The recombinant N-terminal region of human salivary mucin MG2 (MUC7) contains a binding domain for oral Streptococci and exhibits candidacidal activity. Biochem J; 345: 557–564, 2000.
Liu B. et al. Expression of membrane-associated mucins MUC1 and MUC4 in major human salivary glands. J Histochem Cytochem; 50(6):811-20, 2002.
Marcucci, G & Araújo, NS. Citologia esfoliativa. In: TOMMASI, AF & GARRAFA, V. Câncer Bucal.  São Paulo: Medisa editora. 1980, p. 393-407.
Nieuw, AV. et al. Saliva – the defender of the oral cavity. Oral Diseases; 8:12-22, 2002.
Ogden, GR. et al. Oral exfoliative cytology: review of methods of assessment. J Oral Pathol Med; 26:201-5, 1997.
Pedersen, AM. et al. Saliva and gastrointestinal functions of taste, mastication, swallowing and digestion. Oral Diseases; 8:117-29, 2002.
Pereira-Pinto et al. Biopsia e processamento laboratorial. In: Patologia Básica: Sinopse. Natal: EDUFRN, 1997, p.19-35.
Piludu M. et al. Electron microscopic immnugold localization of salivary mucins MG1 and MG2 inhuman submandibular and sublingual glands. J Histochem Cytochem; 51(1):69-79, 2003.
Rovin S. An assessment of the negative oral cytologic diagnosis. JADA; 74:759-62, 1967.
Sandrin, R. Análise comparativa entre a citologia esfoliativa em base-líquida e a citologia esfoliativa convencional no diagnóstico de candidose bucal. 2003 (Dissertação de mestrado em Odontologia). PUCPR/Curitiba  59p.
Sciubba, JJ. Improving detection of precancerous and cancerous oral lesions. Computed-assited analysis of the oral brush biopsy. U.S. Collaborative OralCDx Study Group. JADA; 130(10):1445-57, 1999.
Shklar G. et al. Reliability of cytology smear in diagnosis of oral cancer: a controlled study. Arch Otolaryngol; 91:158-60, 1970.
Sugerman, PB & Savage, NW. Exfoliative cytology in clinical oral pathology. Australian Dental J; 41(2):71-4, 1996.
Thomsson, KA. et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology; 12(1):1-14, 2002. Thornton, DJ. et al. Salivary mucin MG1 is comprised almost entirely of different glycosylated forms of MUC5B gene product. Glycobiology; 9(3):293-302, 1999.
Thylstrup, A & Fejerskov, O. Cariologia Clínica. 3ª edição. São Paulo: Editora Santos, 2001. 17-43.
Veerman EC. et al. Distinct localization of MUC5B glycoforms in the human salivary glands. Glycobiology;13(5):363-6, 2003.

Voltar